近期，福彩3d太湖钓叟分子生理所周雷课题组在Photochemical & Photobiological Sciences (Springer; 欧洲光生物学和光化学学会官方杂志)发表了题为Targeted photodynamic neutralization of SARS-CoV-2 mediated by singlet oxygen的研究论文。此工作首次应用遗传可编码光敏剂和特异抗体实现靶向光动力学中和新冠病毒，在相关领域为国际首创，为临床治疗包括新冠病毒感染在内的疾病开创了新的治疗思路，在分子水平增加了针对单线态氧分子这一化学性质活泼具有重要生理功能，且十分神秘的细胞信号分子的理解。
在过去的三年里，新型冠状病毒在全世界范围肆虐，传染性更高和致命性更强的变异种不断蔓延。目前针对新冠病毒的药物主要包括RdRP抑制剂、蛋白酶抑制剂、中和抗体、大分子非中和抗体药。但现有的RNA聚合酶抑制剂类药物和蛋白酶抑制剂类药物的临床治疗效果尚不理想，而小分子药物的研发周期长达数年。针对COVID-19的抗体药物显示出良好的前景，“疫苗+抗体”被认为是最佳的防治组合手段。然而多种突变毒株的出现，使得许多抗体的中和效价显著降低，这使单克隆抗体治疗的有效性和疫苗保护效果面临严峻挑战。如何应对新冠病毒不断演化，开发具有广谱效应的药物和治疗方法是亟待解决的重要问题。光动力治疗（PDT）是一种药械结合的治疗技术，在临床上被广泛用于治疗多种癌症、皮肤浅表肿瘤及增生性疾病、眼疾等。另外PDT在抗细菌和抗病毒方面也崭露头角，对某些抗药性细菌和包括HPV和HIV在内的病毒表现出独特功效。
作者提出如下科学问题：是否可以通过抗原抗体的特异性结合，介导光敏蛋白和化学光敏剂对新冠病毒表面蛋白进行氧化损伤，从而达到光动力学杀伤新冠病毒的目的？主要基于生物化学结合实验和假病毒感染分析，作者的实验结果证明了这个研究思路的可行性。利用针对刺突蛋白受体结合结构域保守位点的高亲和力抗体，作者应用分子生物学手段将可遗传编码的光敏蛋白SOPP3与抗体融合，进而通过光动力学手段达到杀伤病毒从而阻止病毒对宿主细胞的感染（图1）。
图 1. 抗体融合光敏蛋白靶向SARS-CoV-2表面Spike蛋白并发挥光毒性作用。(A) 靶向中和SARS-CoV-2病毒的实验设计。(B) S309Fab(HS+L)结合WT-spike蛋白的复合物结构示意图 (AlphaFold模拟). 蓝色, RBD; 黄色, NTD; 青色,抗体重链; 绿色, 抗体轻链; 红色, SOPP3. S309 从一位2003 SARS病人体内分离得到的抗体，能识别SARS-CoV-2的spike蛋白。(C) 上图,S309Fab和 Ab-SOPP3融合蛋白的SDS-PAGE胶（考马斯亮蓝染色）。下图, 纯化的WT-spike和Omicron-spike蛋白的Western blot分析结果。（D）利用BioLayer Interferometry (BLI) 技术检测S309Fab(HS+L)与WT-spike蛋白之间的亲和力。相关文章已经送审。
(A)LI) assay of binding of S309Fab(HS+L) to WT spike.
在选择针对刺突蛋白的抗体方面，因为Spike蛋白的RBD区域是病毒与ACE2结合的首要部分，本课题首选选择了以RBD为靶点的人源和纳米抗体。但是作者选择的侧重点并非抗体对病毒中和能力的强弱，工作中包含了结合保守序列（Spike蛋白的NTD区域）且对病毒无中和效果或中和效果甚微的抗体。主要目的是1）更好地探究光敏化抗体对病毒感染率的影响及对刺突蛋白Spike的光修饰；2）实现广谱抗新冠病毒新型变种的效果。
此项工作的主要步骤如下：根据已有的针对新冠的抗体库和蛋白结构信息，设计抗体与光敏蛋白融合方案，构建表达载体并表达纯化融合蛋白；构建RBD及Spike相关克隆并表达、纯化；利用稳定过表达ACE2的Hela细胞进行体外假病毒中和实验，评估正常中和组，光照组及其他对照组中抗体阻止病毒感染细胞的能力（图2）；利用生物膜层干涉技术检测光敏剂标记抗体对RBD及Spike的生物化学结合；通过检测单线态氧在1270nm附近的自发磷光及单线态氧荧光探针SOSG检测光动力学过程中单线态氧分子的产生；质谱检测刺突蛋白Spike被光动力学修饰的化学本质，验证特异抗体的结合位点与spike被修饰位点之间的关系，并辅助设计新的抗体（图3）。
图 2. 光动力学中和反应实验及部分delta 假病毒分析结果. (A) 一系列不同浓度的Ab-SOPP3与SARS-CoV-2在37℃孵育30 mins，随后进行光照/不光照处理，然后加入到过表达ACE2的Hela细胞中。(B) 左，光刺激没有影响 S309Fab (不含SOPP3) 对 Delta假病毒的中和作用。中间， 光刺激后，S309Fab(H+LS)（轻链含有sopp3）对Delta假病毒的中和作用增强。右，光刺激后，S309Fab(HS+L)（重链含sopp3）对Delta假病毒的中和作用增强。
图 3. 利用质谱分析¹O₂介导的Spike蛋白光氧化修饰效果. (A) 含Y145和H146的肽段的质谱图。红圈表示H146发生的氧化修饰.从左到右，无光照、增加单个氧原子(光照处理)、增加两个氧原子(光照处理)。(B)左，单个WT spike蛋白与S309Fab(HS+L)形成复合物的模拟结构。在四次重复实验中，蓝色箭头所标注的残基的氧化修饰出现2次，黄色3次，红色4次。右图，含Y145与H146的区域放大版，这两个残基位于NTD的“supersite”区域，且在光动力学过程中被氧化。
此项工作涉及到了针对不同Spike结构域的11个抗体，包括针对NTD区域的5个非中和抗体，针对RBD区域的6个抗体(4个中和抗体，2个非中和抗体)。体外中和实验结果表明，与光敏蛋白SOPP3融合后的非中和抗体，在蓝光照射后，可以有效阻止病毒对细胞的感染，与非光照组相比，其中①NTD光敏抗体介导的中和效率达到40%-80%不等，其中DH1055光敏抗体IC50约400ng/ml；②RBD中和抗体介导的中和效率均可达到90%以上，其中IC50介于50ng/ml-170ng/ml之间；③非中和RBD抗体在光照后介导中和效率达90%以上，IC50约400ng/ml；④光敏抗体阻止病毒感染细胞的能力与抗体浓度和光照时间呈正比；⑤结合于Spike不同部位的抗体在光照后表现出不同程度的中和能力，表明光敏蛋白和Spike之间的空间距离对光修饰作用存在重要影响。
此项工作全部在福彩3d太湖钓叟完成，组内的姚如惠（研究助理）和侯建（博士后）为本文共同第一作者，周雷资深研究员为本文通讯作者。作者特别致谢钟国才课题组、福彩3d太湖钓叟平台部质谱中心、北京大学谢晓亮曹云龙课题组、西湖大学周强课题组在实验材料和技术方面的帮助。
周雷课题组主要从事离子通道的生物物理机制和生理功能的研究。课题组致力于研究单线态氧分子修饰膜蛋白包括离子通道已经超过10年。在2014年发表的工作中（Gao et al, Photodynamic transformation of HCN2 channel by singlet oxygen，JGP），首次报道了光动力学修饰HCN通道的现象，结合多种实验手段确定了单线态氧分子的主要作用，沿着1O2修饰蛋白质的时间和空间特异性这一思路发现了光动力学修饰HCN通道的开放状态依赖性并确认一个位于通道门附近的组氨酸起到重要作用，从而建立了一个基于分离细胞膜片的极简研究单线态氧修饰蛋白质的工作模型。在2020年发表的工作中（Wei et al, Photodynamic modification of native HCN channels expressed in thalamocortical neurons, ACS Chem Neurosci），首次在小鼠丘脑神经元中应用光动力学修饰HCN通道实现对神经元基础生理学指标的调控，从而为发展光动力学-光化学修饰离子通道成为一种新型调控神经生理活动的生物光子学-光遗传学手段打下基础。这些前期工作尚属基础科学范畴；通过探索靶向光动力学中和新冠病毒，此项工作拓展了单线态分子修饰生物大分子在转化科学和临床实践中的应用。
原文信息：
Targeted photodynamic neutralization of SARS-CoV-2 mediated by singlet oxygen
课题组简介：
/en/scientificresearch/researchteam/383.html
供稿 | 周雷课题组
编辑 | 鲍 啦
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